蛋白質(zhì)這一新技術(shù)為科研人員深入了解活細胞中蛋白質(zhì)組半衰期動力學開辟了新途徑。
清除不必要或有害的蛋白質(zhì)是細胞進行自身調(diào)控的重要途徑之一。在生物體中主要通過兩種機制來實現(xiàn)：一種是通過蛋白酶體降解蛋白質(zhì)，而另一種則是以細胞生長的方式對細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)進行稀釋?？焖俜至训募毎缂毦饕且蕾?ldquo;稀釋”的方式，而終末分化的哺乳動物細胞則主要是通過蛋白質(zhì)降解的途徑。“由于蛋白質(zhì)的清除途徑通常取決于細胞的類型，科學家們常常忽略了降解和稀釋之間存在的平衡關(guān)系
脈沖追蹤術(shù)和蛋白質(zhì)合成抑制法來檢測蛋白質(zhì)的降解速率。盡管脈沖追蹤術(shù)已被應(yīng)用了數(shù)十年，然而由于這種方法需要使用放射性標記和蛋白特異性抗體，使其應(yīng)用范圍受到很大的限制；而蛋白質(zhì)合成抑制劑則有可能會擾亂細胞的功能
在這篇文章中研究人員開發(fā)了一種檢測蛋白質(zhì)半衰期的新技術(shù)，將其命名為“漂白追蹤”（bleach-chase）術(shù)。他們首先利用熒光YFP標簽標記目的蛋白，進而利用短暫的閃光脈沖使10-60%的熒光基因失去熒光（即所謂“漂白”）,由于時間短暫因此不會對細胞造成影響。
“漂白促使標記蛋白分為了兩種亞群：熒光蛋白和非熒光蛋白。而理論上漂白后細胞不會再合成新的非熒光蛋白，熒光的衰減則只可能是依賴于蛋白質(zhì)清除，”Eden解釋說：“我們利用熒光時差顯微術(shù)對漂白細胞和非漂白細胞進行了觀測，通過比較兩種細胞中的熒光水平改變從而獲得了非熒光蛋白的動力學數(shù)據(jù)。”
‘漂白追蹤’術(shù)除了能準確定量蛋白質(zhì)的半衰期，還能幫助科學家鑒別哪些蛋白發(fā)生了活性降解，哪些蛋白則隨細胞分裂而發(fā)生了稀釋，”Eden說：“我們在試驗中針對人類癌細胞中100種不同的蛋白質(zhì)進行了降解和稀釋分析，發(fā)現(xiàn)在檢測時間段中48%的蛋白質(zhì)出現(xiàn)了降解，10%的蛋白質(zhì)發(fā)生了稀釋，而42%的蛋白則同時存在降解和稀釋。”
在進一步的研究中，Eden等利用一種化療藥物對細胞施加壓力以減慢細胞的生長速率，觀測這一效應(yīng)對于蛋白質(zhì)清除的影響。研究人員觀察到盡管短半衰期蛋白質(zhì)沒法發(fā)生變化，但長半衰期蛋白質(zhì)則經(jīng)過更長時間的稀釋在更大程度上被清除。當他們檢測以不同速率減慢細胞生長的其他壓力時，觀察到了相同的效應(yīng)。“我們認為這是一種相當普遍的現(xiàn)象，”Eden說：“這一簡單原理幫助我們更深入地了解了對應(yīng)不同壓力時蛋白質(zhì)清除率變化。值得注意的是，研究結(jié)果表明細胞并沒有利用蛋白質(zhì)降解來補償稀釋率的變化。
“相比于常規(guī)的脈沖追蹤術(shù)完成這些試驗非常的簡單，并且可以更快速地生成結(jié)果。它使得科學家們能夠真正實現(xiàn)大規(guī)模蛋白質(zhì)半衰期檢測，”Eden指出：“然而其存在的*缺點就是蛋白質(zhì)必須首先進行熒光標記，這有可能會對細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)清除產(chǎn)生影響，但我們已非常小心的利用脈沖追蹤對比試驗排除了這種可能性。”
相信隨著熒光標記蛋白庫日益廣泛地應(yīng)用于越來越多的生物體，這項新技術(shù)也將顯示出更加廣泛的用途。
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