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硝酸還原酶(NR)測試盒測定意義

硝酸還原酶(NiR)是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶，廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，是自然界氮循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為NO或NH3，從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。

測定原理

亞硝酸還原酶可將NO2—還原為NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的NO2—減少，即540nm處吸光值的變化可反應(yīng)土壤中亞硝酸還原酶的活性。

需自備的儀器和用品

天平、研缽、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、水浴鍋、低溫離心機。
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1.按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行室溫勻漿，然后轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP 管中，蓋緊后（防止水分散失）置于沸水浴提取15 min；自來水冷卻后，8000g，，4℃離心10min，上清液置冰上待測。

2.細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3.血清等液體：直接檢測。

計算公式如下：

1、血清（漿）LAP活力的計算:

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘生成1 nmol的對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=205.8×ΔA

2、組織、細菌或細胞中LAP活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol 對硝基苯胺定義為一個酶活力單位。

LAP（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(2000×V樣÷V樣總) ÷T=0.103×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：對硝基苯胺摩爾消光系數(shù)，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；2000：細菌或細胞總數(shù)，2000萬。

注意事項：

1. 試劑盒中試劑三、試劑四和標(biāo)準(zhǔn)品均需臨用前配制，且避光保存，配制好未使用完的4℃保存且3天內(nèi)使用完畢。

2. 為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個樣做預(yù)實驗，如果測定的吸光值過高（高于2.5），用蒸餾水稀釋后再測定。

3. 與茚三酮反應(yīng)在570nm處無吸收峰，因此，570nm處測定結(jié)果不含這兩種氨基酸的量。

4．檢出限為100μmol/L。

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